
這篇文章探討了一種以安全、非侵入性且葡萄糖反應的微型裝置,用於補充胰高血糖素。這種裝置旨在避免糖尿病患者在治療過程中,因胰島素過量、導致致命低血糖的後果。研究使用了3D列印輔助模具鑄造技術,開發出一種微型加工方法,可有效清除製造過程中的有毒物質殘留。透過基質體積變化介導的釋放動力學,控制開發葡萄糖響應性透皮胰高血糖素微針貼片,透皮貼片可以降低低血糖的發生,與降低治療過程中、單體殘留所引起的刺激風險。此收縮方法,擺脫了微結構設計成型解析度的限制,在第1型糖尿病小鼠模型中也證明了效果。
胰高血糖素微針貼片製造革新:安全、高效的治療選擇
2.1-3D列印微針貼片的收縮製造

(A) 收縮製造過程的示意圖。(B) 1.5 圓錐形(上圖)和 1.5 金字塔形(下圖)MN 貼片收縮前(中)和收縮後(右)的3D設計圖和影像。比例尺,3 毫米。(C) 1.5 圓錐形(上)和 1.5 金字塔形(下)的 MN 貼片的 SEM 圖。比例尺,500 µm。不同MN完全收縮後的(D)針尖基部寬度和(E)針高變化。數據點為平均值±SD ( n = 8)。
2.2-葡萄糖響應性胰高血糖素釋放的微針基質設計
為了追求有效的遞送,控制胰高血糖素的釋放在純化步驟和治療過程中同樣重要。與其反調節夥伴胰島素在生理 pH 下顯示負電荷不同,胰高血糖素的 pI 值約為 7.1,使其在生理環境中處於接近中性的電荷狀態。因此,響應性釋放設計主要依賴基質在指定葡萄糖濃度下的膨脹和收縮轉變。這裡,葡萄糖響應性收縮(GRS)基質是丙烯酰胺、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基銨(MAETAC)和3-(丙烯酰氨基)苯基硼酸(APBA)的共聚物,以雙丙烯醯胺為交聯劑,過硫酸銨(APS)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作為催化劑。這種組合確保了溫和而快速的聚合,耐洗滌,並表現出理想的收縮率和皮膚滲透的機械剛性。陽離子聚丙烯醯胺(CPAM)充當封裝胰高血糖素勝肽的支架,APBA可作為葡萄糖響應性電荷調節單元。響應低葡萄糖水平的胰高血糖素遞送機制歸因於 CPAM/APBA 聚合物網絡的淨電荷從陽離子轉移到中性(圖 2A)。當發生低血糖時,排斥性陽離子基質可以促進胰高血糖素的釋放,以糾正危險的低血糖。隨著血漿葡萄糖的增加,與 APBA 結合的葡萄糖分子數量增加,可以貢獻更多的負電荷,進而促進靜電吸引(圖 2B)。這導致「緊緊抓住」基質狀態,限制過量的胰高血糖素釋放。

(A)示意圖顯示,在低血糖條件下,陽離子聚丙烯醯胺基質中擴張的空腔促進胰高血糖素的釋放。隨著葡萄糖水平升高,帶負電荷的葡萄糖-硼酸鹽複合物中和周圍的排斥力,從而引起聚合物收縮並減慢胰高血糖素擴散。(B)可清洗的葡萄糖反應性胰高血糖素 MN 的濃度依賴性葡萄糖結合能力。(C)聚合物基質的長時間預洗可增加細胞活力。(D)透過在50和400mg dL -1之間交替葡萄糖濃度連續三個循環來脈動胰高血糖素釋放。在 37 °C、pH 7.4 下,在不同葡萄糖濃度下預洗 1 小時前和 (F)後,GRS 胰高血糖素 MN 貼片 (E)中累積的胰高血糖素釋放量。數據點為平均值±SD ( n = 3)。**** p < 0.0001。
利用基質的葡萄糖濃度敏感的體積改變行為,在補充400mg dL -1葡萄糖的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌緩衝液中進行純化以攔截胰高血糖素損失。透過過夜孵育評估純化時間長度與基質對小鼠纖維母細胞 L929 細胞的細胞毒性(圖 2C)。MTT結果顯示,在洗滌液中浸泡30分鐘後,細胞活力從約45%增加至約77%。純化 1 小時後,基質顯示出可忽略不計的細胞毒性,在此期間觀察到總胰高血糖素的 2 wt% 浸出(圖S3)。隨著純化時間延長至 24 小時,胰高血糖素流失百分比加倍。為了最大限度地減少有效負載的損失,其餘實驗採用 1 小時的洗滌時間。
透過在低葡萄糖水平(50 mg dL -1 )和高葡萄糖水平(400 mg dL -1 )PBS溶液中交替孵育聚合物基質來表徵脈動胰高血糖素釋放曲線。三個葡萄糖響應釋放週期(圖 2D)被證明,每個週期消耗後釋放量逐漸下降。純化前後,在體外觀察到葡萄糖濃度和胰高血糖素釋放動力學之間類似的負相關性(圖 2E,F),因此純化不會幹擾葡萄糖反應功能。
2.3-GRS 胰高血糖素 MN 貼片的體內純化及葡萄糖反應評價

(A)1小時純化前後可浸出單體的 HPLC 定量。(B)GRS 胰高血糖素 MN 貼片的機械性質。在使用收縮的 MN 陣列貼片處理後,透過用台盼藍對小鼠背部皮膚進行染色來評估 MN 插入(插圖)。比例尺,3 毫米。(C)PGLs 和(D)糖尿病小鼠在高血糖狀態和低血糖狀態(透過 15 小時禁食和皮下注射 75 µg kg -1胰島素),分別。(E)PGL和(F)以貼片治療的糖尿病小鼠(胰高血糖素劑量:40mg kg -1 )中的血漿胰高血糖素濃度,在貼片施用後1小時通過腹膜內注射3mg kg -1胰島素來激發小鼠。數據表示平均值±SD(n = 5)。統計顯著性透過雙尾學生t檢定確定。* p < 0.05,** p < 0.01。
儘管最初具有凝膠狀結構,但與各種報導的 MN 相比,完全收縮的 GRS 胰高血糖素 MN 貼片表現出優異的機械強度。每針平均斷裂力超過40 N,這使得後續研究中可以輕鬆穿透皮膚(圖 3B和圖S5)。透過表徵GRS 胰高血糖素MN 貼片在兩組鏈脲佐菌素誘導的1 型糖尿病小鼠上的釋放曲線來評估體內葡萄糖反應性:一組患有高血糖狀況(未經治療),另一組患有低血糖狀況(經15 小時禁食和15 小時禁食治療)。皮下注射75 µg kg -1胰島素)。使用酵素連結免疫吸附測定 (ELISA) 進行的血漿胰高血糖素定量顯示,低血糖組在給藥後 3 小時開始釋放較高的胰高血糖素,這與隨後持續的正常血糖水平一致。相較之下,未經治療的糖尿病小鼠組血漿胰高血糖素水平沒有顯著升高,這也反映在穩定的血漿葡萄糖水平(PGL)中(圖 3C-D)。我們進一步進行了腹腔內胰島素耐受試驗(IPITT),在GRS胰高血糖素MN貼片給藥後1小時腹膜內注射3 mg kg -1胰島素。為了回應胰島素挑戰,PGL 下降並在 1.5 小時內接近低血糖(圖 3E)。因此,在 PGL 下降後觀察到血漿胰高血糖素水平逐漸增加(圖 3F)。綜上所述,GRS 胰高血糖素 MN 貼片顯示出葡萄糖調節釋放模式。
2.4-GRS 胰高血糖素 MN 貼片的體內血漿葡萄糖濃度控制性能

(A)以貼片治療的糖尿病小鼠(胰高血糖素劑量:40 mg kg -1)與對照小鼠(未治療)的PGL。(B)處於低血糖狀態的糖尿病小鼠的 PGL(透過注射 75 µg kg -1胰島素過夜 15 小時禁食誘導),有或沒有貼片給藥(胰高血糖素劑量:40 mg kg -1)。(C)在升糖素貼片施用後1小時(由箭頭指示)注射3mg kg -1胰島素後PGL恢復(胰高血糖素劑量:40 mg kg -1)。(D)從室溫保存(2或4週)的MN貼片中提取的胰高血糖素對處於低血糖狀態(透過皮下注射3 mg kg -1胰島素誘導)的糖尿病小鼠的PGL增加能力。分別在皮下注射前和皮下注射後4小時監測低血糖小鼠的PGL。數據表示平均值±SD(n = 5)。統計顯著性由雙尾學生 t 檢定確定。*p < 0.05,**p < 0.01。
3-討論與結論
透過這種保證純化的製造概念,可以採用生物相容性較差的聚合材料和分子的增強庫進行微針製造,實現所需的基質功能化。未來對溶脹狀態下,具有脫水特性的各種聚合物的溶劑比與最終收縮率之間的相關性的探索,可以賦予縮放以增加的可編程性。我們預計將該方法,3D列印微針製造,在微流體、軟機器人、穿戴式感測器以及涉及與組織,直接接觸的各種生物醫學用途中廣泛應用。
參考文獻: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202203274

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