微針貼片應用於低血糖無痛治療(葡萄糖與高血糖)

Shrinking Fabrication of a Glucose-Responsive Glucagon Microneedle Patch

這篇文章探討了一種以安全、非侵入性且葡萄糖反應的微型裝置,用於補充胰高血糖素。這種裝置旨在避免糖尿病患者在治療過程中,因胰島素過量、導致致命低血糖的後果。研究使用了3D列印輔助模具鑄造技術,開發出一種微型加工方法,可有效清除製造過程中的有毒物質殘留。透過基質體積變化介導的釋放動力學,控制開發葡萄糖響應性透皮胰高血糖素微針貼片,透皮貼片可以降低低血糖的發生,與降低治療過程中、單體殘留所引起的刺激風險。此收縮方法,擺脫了微結構設計成型解析度的限制,在第1型糖尿病小鼠模型中也證明了效果。

胰高血糖素微針貼片製造革新:安全、高效的治療選擇

低血壓是糖尿病治療中常見的狀況,在補充胰島素或服用胰島素期間經常發生劑量過量的情況,較輕微時,會出現注意力不集中、出汗、心慌和視力變化等症狀,可通過攝入碳水化合物解決;嚴重時,則會出現失去知覺、昏迷等症狀,危及生命。因此,在這些不可預見的低血糖緊急情況下,需要及時補充胰高血糖素。 為因應這些緊急情況,開發了一種高精密3D列印技術製造的微針貼片,提供非侵入性且有效的胰高血糖素遞送方案。這種新型微針貼片利用3D列印微針母模鑄造的PDMS模具,縮小響應胰高血糖素微針貼片的製造,該模具可以剛性聚合後清洗。特性與後續的清洗步驟相結合,可以防止預先加載的胰高血糖素的物理和生物活性損失,同時將有毒的重負荷物消除到安全水平。微針貼片能夠智慧調控胰高血糖素釋放,提升治療的便利性和安全性。提高藥物生物可用性並簡化製造流程,不僅實現了對藥物釋放動力學的精確控制,也確保了治療的高效性和患者的舒適性。此技術在糖尿病模型小鼠中證明了其對抗低血糖的有效性,展示了高精密3D列印與微針技術,在製造下一代醫療設備中的巨大潛力。

2.1-3D列印微針貼片的收縮製造

針對聚合物微針形狀固定後純化所引起的結構變形的困境,收縮製造概念的重點是切換這兩個過程的順序。簡而言之,利用模鑄製程首先產生具有確定形狀和排列的相對較大的初步微針凝膠,然後進行脫水以最終實現尺寸小型化(圖 1A)。初始的凝膠狀狀態可輕鬆控制微針形狀、成型過程和純化,而收縮步驟可確保保留微型微針的形狀細節和機械強度。
3D列印實例:葡萄糖響應型胰高血糖素微針陣列貼片製備過程
圖1、微針貼片的收縮製造。
(A) 收縮製造過程的示意圖。(B) 1.5 圓錐形(上圖)和 1.5 金字塔形(下圖)MN 貼片收縮前(中)和收縮後(右)的3D設計圖和影像。比例尺,3 毫米。(C) 1.5 圓錐形(上)和 1.5 金字塔形(下)的 MN 貼片的 SEM 圖。比例尺,500 µm。不同MN完全收縮後的(D)針尖基部寬度和(E)針高變化。數據點為平均值±SD ( n = 8)。
為了評估整個收縮製造過程中的結構保存精度,使用商用 3D 列印機對錐形或金字塔形微針母模進行 3D 列印,以產生複製 PDMS 模具(圖1B和圖 S1)。擴大的“毫米尺寸”模具只需通過移液和超音波處理即可快速澆注預冷的聚合物溶液。5 分鐘的聚合過程在 37°C 培養箱中進行,避免了在熱或紫外線誘導的形狀固定過程中對貨物蛋白造成的潛在損害。純化後,將凝膠狀微針安裝在透明聚碳酸酯薄膜上,半密封緩慢脫水,直到微針底座與聚碳酸酯薄膜脫離。 在收縮過程中,由於聚碳酸酯薄膜的穩定性,貼片底部的厚度可以減小,同時保持其原始尺寸和形狀。類似地,每個微針尖端之間的中心距離保持不變,但微針尖端本身水平和垂直收縮以獲得均勻的預定義形狀(圖 1B,C)。
這種收縮模式反映在所評估的所有三組MN 中:1.5 毫米尖端基部寬度的錐形MN(1.5 錐體)、1.5 毫米尖端基部寬度的金字塔形MN(1.5 金字塔)和2.0 毫米尖端基部寬度的錐形MN. MN(2 個錐體)。測量 1.5 錐體(寬39.7 %,高 30.5%)、1.5 錐體(寬 40.8%,高 27.4%)和 2 錐體(寬 39.9%,高 27.4%)的尖端基部寬度(w)和高度(寬 39.9%,高 27.4%)的尖端基部寬度(w)和高度(寬 h ) 31.0%)形狀的微針,分別(圖 1D,E)。一般來說,圓錐形和金字塔形微針具有相似的收縮模式,其中垂直方向的收縮率較高。考慮到易於製作和收縮均勻,後續實驗採用可收縮為0.6×0.8 mm微針的6×6 mm錐形微針模具(1.5 mm寬×2.7 mm高)。與葡萄糖誘導的體積變化釋放機制相關,當重新浸入含葡萄糖的 PBS 溶液中時,觀察到 GRS 胰高血糖素 MN 貼片的葡萄糖依賴性腫脹(圖S2)。

2.2-葡萄糖響應性胰高血糖素釋放的微針基質設計

為了追求有效的遞送,控制胰高血糖素的釋放在純化步驟和治療過程中同樣重要。與其反調節夥伴胰島素在生理 pH 下顯示負電荷不同,胰高血糖素的 pI 值約為 7.1,使其在生理環境中處於接近中性的電荷狀態。因此,響應性釋放設計主要依賴基質在指定葡萄糖濃度下的膨脹和收縮轉變。這裡,葡萄糖響應性收縮(GRS)基質是丙烯酰胺、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基銨(MAETAC)和3-(丙烯酰氨基)苯基硼酸(APBA)的共聚物,以雙丙烯醯胺為交聯劑,過硫酸銨(APS)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作為催化劑。這種組合確保了溫和而快速的聚合,耐洗滌,並表現出理想的收縮率和皮膚滲透的機械剛性。陽離子聚丙烯醯胺(CPAM)充當封裝胰高血糖素勝肽的支架,APBA可作為葡萄糖響應性電荷調節單元。響應低葡萄糖水平的胰高血糖素遞送機制歸因於 CPAM/APBA 聚合物網絡的淨電荷從陽離子轉移到中性(圖 2A)。當發生低血糖時,排斥性陽離子基質可以促進胰高血糖素的釋放,以糾正危險的低血糖。隨著血漿葡萄糖的增加,與 APBA 結合的葡萄糖分子數量增加,可以貢獻更多的負電荷,進而促進靜電吸引(圖 2B)。這導致「緊緊抓住」基質狀態,限制過量的胰高血糖素釋放。

3D列印實例:GRS 胰高血糖素遞送系統的機制與體外性能
圖2、GRS 胰高血糖素遞送系統的機制與體外性能。
(A)示意圖顯示,在低血糖條件下,陽離子聚丙烯醯胺基質中擴張的空腔促進胰高血糖素的釋放。隨著葡萄糖水平升高,帶負電荷的葡萄糖-硼酸鹽複合物中和周圍的排斥力,從而引起聚合物收縮並減慢胰高血糖素擴散。(B)可清洗的葡萄糖反應性胰高血糖素 MN 的濃度依賴性葡萄糖結合能力。(C)聚合物基質的長時間預洗可增加細胞活力。(D)透過在50和400mg dL -1之間交替葡萄糖濃度連續三個循環來脈動胰高血糖素釋放。在 37 °C、pH 7.4 下,在不同葡萄糖濃度下預洗 1 小時前和 (F)後,GRS 胰高血糖素 MN 貼片 (E)中累積的胰高血糖素釋放量。數據點為平均值±SD ( n = 3)。**** p < 0.0001。

利用基質的葡萄糖濃度敏感的體積改變行為,在補充400mg dL -1葡萄糖的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌緩衝液中進行純化以攔截胰高血糖素損失。透過過夜孵育評估純化時間長度與基質對小鼠纖維母細胞 L929 細胞的細胞毒性(圖 2C)。MTT結果顯示,在洗滌液中浸泡30分鐘後,細胞活力從約45%增加至約77%。純化 1 小時後,基質顯示出可忽略不計的細胞毒性,在此期間觀察到總胰高血糖素的 2 wt% 浸出(圖S3)。隨著純化時間延長至 24 小時,胰高血糖素流失百分比加倍。為了最大限度地減少有效負載的損失,其餘實驗採用 1 小時的洗滌時間。

透過在低葡萄糖水平(50 mg dL -1 )和高葡萄糖水平(400 mg dL -1 )PBS溶液中交替孵育聚合物基質來表徵脈動胰高血糖素釋放曲線。三個葡萄糖響應釋放週期(圖 2D)被證明,每個週期消耗後釋放量逐漸下降。純化前後,在體外觀察到葡萄糖濃度和胰高血糖素釋放動力學之間類似的負相關性(圖 2E,F),因此純化不會幹擾葡萄糖反應功能。

2.3-GRS 胰高血糖素 MN 貼片的體內純化及葡萄糖反應評價

在體內部署 GRS 胰高血糖素 MN 貼片之前,我們研究了 1 小時純化過程中殘留單體的清除功效。將製備好的貼片浸入 PBS 中 3 小時,以收集可浸出的單體,並使用高效液相層析儀(HPLC,表S1)進行定量。純化後,可浸出丙烯醯胺、APBA 和 MAETAC 的總量分別減少了 16、40 和 31 倍(圖 3A,表S2和S3)。表S3支援資訊中顯示的可浸出單體的偵測量完全在報告資料庫的安全範圍內。此外,分別評估了用預洗或後洗的 GRS 胰高血糖素 MN 貼片處理 24 小時的小鼠皮膚的蘇木精和伊紅 (H&E) 染色。與洗後組相比,預洗組在第 3 天經歷了真皮厚度增加和明顯炎症,這再次證實了皮膚接觸裝置的淨化必要性。對於兩組,停藥後 1 週,給藥部位的發炎(如果有的話)大部分已痊癒(圖S4)。
3D列印實例:GRS 胰高血糖素 MN 貼片的體內純化及葡萄糖反應評價
 圖3、GRS 胰高血糖素 MN 貼片的純化和體內葡萄糖響應性能的評估。
(A)1小時純化前後可浸出單體的 HPLC 定量。(B)GRS 胰高血糖素 MN 貼片的機械性質。在使用收縮的 MN 陣列貼片處理後,透過用台盼藍對小鼠背部皮膚進行染色來評估 MN 插入(插圖)。比例尺,3 毫米。(C)PGLs 和(D)糖尿病小鼠在高血糖狀態和低血糖狀態(透過 15 小時禁食和皮下注射 75 µg kg -1胰島素),分別。(E)PGL和(F)以貼片治療的糖尿病小鼠(胰高血糖素劑量:40mg kg -1 )中的血漿胰高血糖素濃度,在貼片施用後1小時通過腹膜內注射3mg kg -1胰島素來激發小鼠。數據表示平均值±SD(n = 5)。統計顯著性透過雙尾學生t檢定確定。* p < 0.05,** p < 0.01。

儘管最初具有凝膠狀結構,但與各種報導的 MN 相比,完全收縮的 GRS 胰高血糖素 MN 貼片表現出優異的機械強度。每針平均斷裂力超過40 N,這使得後續研究中可以輕鬆穿透皮膚(圖 3B和圖S5)。透過表徵GRS 胰高血糖素MN 貼片在兩組鏈脲佐菌素誘導的1 型糖尿病小鼠上的釋放曲線來評估體內葡萄糖反應性:一組患有高血糖狀況(未經治療),另一組患有低血糖狀況(經15 小時禁食和15 小時禁食治療)。皮下注射75 µg kg -1胰島素)。使用酵素連結免疫吸附測定 (ELISA) 進行的血漿胰高血糖素定量顯示,低血糖組在給藥後 3 小時開始釋放較高的胰高血糖素,這與隨後持續的正常血糖水平一致。相較之下,未經治療的糖尿病小鼠組血漿胰高血糖素水平沒有顯著升高,這也反映在穩定的血漿葡萄糖水平(PGL)中(圖 3C-D)。我們進一步進行了腹腔內胰島素耐受試驗(IPITT),在GRS胰高血糖素MN貼片給藥後1小時腹膜內注射3 mg kg -1胰島素。為了回應胰島素挑戰,PGL 下降並在 1.5 小時內接近低血糖(圖 3E)。因此,在 PGL 下降後觀察到血漿胰高血糖素水平逐漸增加(圖 3F)。綜上所述,GRS 胰高血糖素 MN 貼片顯示出葡萄糖調節釋放模式。

2.4-GRS 胰高血糖素 MN 貼片的體內血漿葡萄糖濃度控制性能

使用鏈脲佐菌素 (STZ) 誘導的胰島素缺乏糖尿病小鼠模型進一步評估了 GRS 胰高血糖素 MN 貼片降低低血糖風險的體內血糖調節能力。GRS 胰高血糖素MN 貼片的低血糖激活胰高血糖素增強劑釋放在兩組糖尿病小鼠中進行了驗證:一組表現出高血糖PGL(未經治療),另一組接受低血糖PGL (禁食15 小時並皮下注射75 µg kg 進行治療- 1胰島素)。以血糖儀監測,與高血糖對照組相比,施用GRS胰高血糖素MN貼片的高血糖組顯示PGL的差異可以忽略不計(圖 4A)。相較之下,在低血糖狀態下,GRS胰高血糖素MN貼片治療組表現出明顯較高的PGL,在給藥後3小時達到並維持在正常範圍(圖4B )。此外,當高血糖小鼠皮下注射過量胰島素(3 mg kg -1)時,GRS胰高血糖素MN貼片可防止PGL降至50 mg dL -1以下,同時在3小時後獲得更快的PGL恢復胰島素挑戰(圖 4C)。這種低血糖逆轉表現也體現在低升糖指數(定義為初始PGL 讀數與最低點PGL 讀數之間的差異除以達到最低點所需的時間)平均值顯著降低為2.6,而未治療組為4.5(圖S6)。
3D列印實例:葡萄糖響應型胰高血糖素微針貼片的保護與保存評價
 圖4、GRS胰高血糖素MN貼片的保護和保存評估。
(A)以貼片治療的糖尿病小鼠(胰高血糖素劑量:40 mg kg -1)與對照小鼠(未治療)的PGL。(B)處於低血糖狀態的糖尿病小鼠的 PGL(透過注射 75 µg kg -1胰島素過夜 15 小時禁食誘導),有或沒有貼片給藥(胰高血糖素劑量:40 mg kg -1)。(C)在升糖素貼片施用後1小時(由箭頭指示)注射3mg kg -1胰島素後PGL恢復(胰高血糖素劑量:40 mg kg -1)。(D)從室溫保存(2或4週)的MN貼片中提取的胰高血糖素對處於低血糖狀態(透過皮下注射3 mg kg -1胰島素誘導)的糖尿病小鼠的PGL增加能力。分別在皮下注射前和皮下注射後4小時監測低血糖小鼠的PGL。數據表示平均值±SD(n = 5)。統計顯著性由雙尾學生 t 檢定確定。*p < 0.05,**p < 0.01。
溫和的 GRS 胰高血糖素 MN 貼片製備過程確保封裝的胰高血糖素在糖尿病小鼠中釋放時表現出與新鮮溶解的胰高血糖素相當的高血糖功能(圖4D)。質譜分析還表明,在微針製造和純化過程之後,胰高血糖素分子結構是完整的(圖S7)。此外,與4℃保存的天然胰高血糖素溶液相比,在室溫下保存的微針保護的胰高血糖素在釋放後表現出更好的高血糖作用。觀察到微針貼片的這種穩定效果至少持續4 週(圖 4D和圖S8)。

3-討論與結論

對臨床應用的聚合物設備進行安全控制至關重要。在此,透過收縮策略解決了消除溶液可變形聚合物元件模組中的有害殘留物而不破壞其確定結構的挑戰。利用聚合物基質響應水溶液存在的體積差異和脫水模式,我們在3D列印微成型過程中推進了形狀固定之前的純化步驟。溶脹狀態使得可浸出單體在洗滌過程中能快速擴散。脫水條件最終成型為所需的小型化尺寸。刺激響應釋放的結合可以有效限制淨化階段的貨物損失。基於葡萄糖響應性胰高血糖素補充微針貼片製造的概念驗證研究在糖尿病小鼠中實現了預期的低血糖逆轉結果,安全性問題可以忽略不計,並且加載的胰高血糖素的功能穩定性延長。
透過這種保證純化的製造概念,可以採用生物相容性較差的聚合材料和分子的增強庫進行微針製造,實現所需的基質功能化。未來對溶脹狀態下,具有脫水特性的各種聚合物的溶劑比與最終收縮率之間的相關性的探索,可以賦予縮放以增加的可編程性。我們預計將該方法,3D列印微針製造,在微流體、軟機器人、穿戴式感測器以及涉及與組織,直接接觸的各種生物醫學用途中廣泛應用。

參考文獻: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202203274

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